Главная

Поток кальция в клетку

Концентрация ионов кальция (Са²⁺) в клетках млекопитающих значительно ниже, чем в окружающей среде. Это приводит к появлению направленного внутрь клетки электрохимического градиента Са²⁺. Поток Са²⁺ не чувствителен к метаболическим ингибиторам и имеет низкий температурный коэффициент, что говорит о его независимости от источников энергии. Для потока Са²⁺ из клетки наружу справедливо противоположное, поскольку в плазматической мембране лимфоцита есть Са²⁺- АТРаза, участвующая в активном транспорте Са²⁺. Ионы Са²⁺ входят внутрь лимфоцита, используя насыщаемый переносчик, причем Мn²⁺ конкурентно ингибирует проникновение Са²⁺ в клетку. Таким образом, механизмом попадания Са²⁺ в клетку является, по-видимому, облегченная диффузия, а выход Са²⁺ из клетки осуществляется путем активного транспорта.

Имеется пять основных экспериментально доказанных фактов, которые, будучи взятыми в совокупности, доказывают центральную роль Са2+ в активации лимфоцитов. Во-первых, уменьшение концентрации Са²⁺ снаружи ниже 10^-3 М ингибирует синтез как ДНК, так и РНК в ответ на добавление ФГА или Кон А. Согласно Витни и Сазерленду, ингибирование митогенеза достигало 75—85%, если концентрацию Са²⁺ снаружи снижали за два часа до стимуляции, и составляло лишь 25% в том случае, когда снижение проводили через 12 ч после начала контакта с митогеном. Изменение концентрации Са²⁺ после 16 ч на активацию не влияло.

Во-вторых, кальциевый ионофор А23187, включаясь в плазматическую мембрану и становясь в результате интегральным белком, образует в мембране кальциевые каналы; в результате проникновение Са²⁺ внутрь резко увеличи-вается, а через несколько дней начинается синтез ДНК. Добавление ионофора в первые 3 ч, а Кон А между 15 и 18 часами приводит точно к такому же синтезу ДНК, как если бы в обоих случаях добавлялся Кон А. Этот результат дает основание предполагать, что ключевая роль Кон А в первые 3 ч заключается в стимуляции проникновения Са²⁺ внутрь клетки.

В-третьих, получены данные о том, что в течение 1—5 мин после контакта с митогеном поглощение 45Са²⁺ лимфоцитами резко (в 2—5 раз) увеличивается.

Лимфоциты периферической крови человека культивировали вместе с 45Са<sup>2+</sup> в присутствии (черные кружки) и в отсутствие ФГА (белые кружки).

ФГА и изотоп добавляли в момент времени «О», после чего культуры инкубировались при 37°С.
Поглощение Са²⁺ выражено в наномолях/миллион лимфоцитов + стандартная ошибка относительно величины, полученной усреднением по 3—4 культурам.

Весь процесс занимает от 30 мин до нескольких часов. Данные о его амплитуде и длительности, полученные в разных лабораториях, сильно варьируют. В Т-лимфоцитах человека, обработанных ФГА, ускорение проникновения Са²⁺ осуществляется в результате уменьшения Кш на 50% без значительного изменения FMaKC, т. е., по-видимому, обработка с по-мощью ФГА увеличивает сродство «переносчика» к Са²⁺, а не количество «переносчиков» или скорость переноса Са²⁺ каждым переносчиком. Поскольку выход Са²⁺ из клеток, в которые арительно был введен 45Са²⁺, также возрастает, эффект действия митогена сводится к увеличению кальциевого обмена.

В-четвертых, кривые зависимости интенсивности проникновения Са²⁺ в клетку и синтеза ДНК от концентрации митогена, по данным нескольких исследователей, совпадают, тогда как АЗП и оксинелла (лектины, не стимулирующие синтез ДНК) либо не влияют на скорость выхода Са²⁺, либо вызывают незначительные изменения.

В-пятых, Кон А и ФГА стимулируют проникновение Са²⁺ только в Т-клетки, а ЛПС — только в В-клетки. В клетках линии C34/HeJ, не синтезирующих ДНК в ответ на воздействие с помощью ЛПС, также не наблюдается раннего увеличения потока Са²⁺ внутрь.

Поскольку проникновение Са²⁺ — процесс, независимый от энергии, действие митогенов сравнивается с открыванием «кальциевых ворот», позволяющих ионам диффундировать в клетку в направлении градиента концентрации. По этим кальциевым каналам Са²⁺ , по-видимому, и проникает в клетку. Некоторая часть попадающего в клетку Са²⁺ может быть быстро удалена из цитоплазмы (например, поглощена митохондриями), однако большая часть должна быть выкачена наружу, поскольку общее количество Са²⁺ в клетке, как следует из данных, полученных методом атомной абсорбционной спектрофотометрии, при индуцируемом ФГА митогенезе не увеличивается сколько-нибудь значительно. Са²⁺-каналы, по-видимому, чувствительны к регуляции с помощью структур, контактирующих с ними с внутренней стороны мембраны, поскольку проникновение Са²⁺ в клетку подавляется колхицином (стимулирующим диссоциацию микротрубочек) и цитохалазинами D и В (препятствующими нормальному функционированию микрофиламентов). Даже несмотря на то, что проникновение Са²⁺ в клетку не требует затрат энергии, оно ингибируется веществами, повышающими содержание циклического GMP или снижающими уровень циклического AMP. Тем не менее цитоплазматическая гуанилат-цикла за активируется потоком Са²⁺ в клетку (т. е. действует механизм отрицательной обратной связи). В принципе вполне возможно, что гуанилатциклаза, функционируя совместно с кальмодулином, усиливает под действием проникшего внутрь Са2+ фосфорилирование ключевых ферментов, передающих активационный сигнал.

В отличие от ЛПС бивалентные антитела против суммарных иммуноглобулинов и IgM не вызывают заметного увеличения потока Са²⁺ в В-клетки. Вместо этого они стимулируют освобождение Са²⁺ из внутриклеточных хранилищ. После этого происходит быстрая потеря клеткой 20—30% общего количества Са²⁺, что, возможно, играет важную роль в кэппинге. В отличие от целых молекул антител их Fab'-фрэгменты не стимулируют кальциевых потоков. Таким образом, как ЛПС, так и антитела против иммуноглобулинов могут вызывать кратковременное увеличение внутриклеточной концентрации Са²⁺, однако причины такого увеличения в двух этих случаях оказываются неодинаковыми, что, возможно, отражает различие в механизмах прохождения сигналов через мембрану.

Существует весьма интересная гипотеза, рассматривающая роль Са²⁺- зависимых трансглутаминаз в активации. Как известно, трансглутаминазы катализируют присоединение глутаминовой кислоты к e-NH2-rpynne лизина, в результате которого два пептида оказываются ковалентно-связанными. В связи с этим возникают следующие вопросы: не находится ли этот фермент в мембране лимфоцита, не активируется ли он вследствие возникающего при стимуляции проникновения Са2+ в клетку и не регулируется ли активность трансглутаминазы полиаминами путем изменения уровня Са²⁺? Имеет место подобный процесс или нет, должны показать эксперименты, которые, по-видимому, скоро будут проведены. Однако, если этот процесс и существует, он, очевидно, не связан с ковалентной сшивкой поверхностных иммуноглобулинов при кэппинге.

Среди реагентов, ингибирующих такие индуцируемые митогеном процессы, как поглощение Са²⁺ и синтез ДНК лимфоцитами, следует назвать липопротеины, полиамины и простагландины E₁ и Е₂.