Главная

Электроиммунный анализ. Методика

Материалы и оборудование. Для работы необходимы моноспецифические, стандартные и контрольные сыворотки, буферные растворы. Можно использовать самые разнообразные буферы. В качестве примера мы приводим состав трех из них: натрий ацетат-натрий-диэтилбарбитуратный буфер рН 8,6.

Барбитуратный буфер рН 8,6, 0,075 М:

Барбитурат натрия 77,0 г
Барбитуровая кислота 13,8 г
Лактат кальция 3,85 г
Азид натрия 1,0 г
Дистиллированная вода до 5000 мл

Перед употреблением буфер можно разводить в 2 раза.

Вероналовый буфер рН 8,6, 0,075 М:

Диэтилбарбитурат натрия 131,4 г
Диэтилбарбитуровая кислота 20,7 г
Лактат кальция 4,0 г
Дистиллированная вода до 10 л

Прочие буферные растворы описаны в других работах. Рекомендуется барбитуровую или диэтилбарбитуровую кислоты растворить в 1—2 л воды при нагревании, внести прочие компоненты, а затем довести смесь до нужного объема дистиллированной водой. Можно использовать агарозу производства разных фирм, например, Feinchemie, Kallis KG (ГДР); Behring-werke AG (ФРГ); Ferak (Западный Берлин); Lindustrie biologique Francaise (Франция) и др. Желательно всегда пользоваться агарозой одной марки и одной серии. Новые образцы агарозы следует подвергать предварительной оценке на годность. Кроме этого, необходимы электрофоретическая камера с охлаждением, микрошприцы для отбора проб (1—10 мкл), измерительное устройство для определения расстояний с точностью до 0,1 мм.

Проведение опыта

Расплав агарозы (1,5%) в барбитуратном буфере с рН 8,6при температуре 48 °С смешивают с моноспецифической сывороткой. Концентрация АС в зависимости от титра, свойств антигенов и других факторов может колебаться в широких пределах. Чаще всего используют концентрации 1—5%. На предметное стекло размером 120х60х2 мм наносят 10 мл смеси, равномерно распределяют ее по поверхности. Пластины рекомендуется подготавливать нанесением слоя водной агарозы. Пластины располагают на подогреваемом (35—40 °С) горизонтальном столике. После застывания геля образуется равномерный слой толщиной около 1 мм. Рекомендуется применение U-образных рамок из пластика высотой 1 мм. Два стекла складывают с помощью такой рамки, образуется плоская камера, которую заполняют золем АС-содержащей агарозы, стараясь избегать образования пузырей. После застывания геля одно стекло удаляют; пластина с гелем готова для использования. На расстоянии 8 мм от длинного края пластины в слое геля проделывают лунки для АГ диаметром 4 мм. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 6 мм. В каждую лунку вносят 10 мкл раствора АГ и проводят электрофорез. Лунки для АГ расположены на катодной части пластины. Напряжение может составлять 20 В/см; температура должна поддерживаться на уровне 4—10 °С. Продолжительность электрофореза может составлять 3—18 ч для разных систем АГ — AT. Оценка результатов проводится на влажном препарате немедленно по окончании электрофореза. Если прецитаты недостаточно различимы, пластины с гелем отмывают для удаления непреципитирующих белков, высушивают и окрашивают; затем проводят оценку результатов.

Электроиммуииый анализ: этапы работы

Электроиммуииый анализ: этапы работы

 Электроиммуииый анализ: определение количества альбумина

 Электроиммуииый анализ: определение количества альбумина

Обработка пластин, оценка результатов

Лунки в геле следует вырезать очень тщательно, края должны быть ровными, гель не должен отставать от стекол, наполнять лунки следует до краев. Электрофорез начинают немедленно после внесения образца в лунки, это делается для предотвращения ИД. Лунки для АГ можно заполнять даже под слабым напряжением, которое затем увеличивают до полного. Концентрацию АГ следует подбирать таким образом, чтобы образовывались преципитаты длиной 10—50 мм. Все разведения АГ готовят на буфере для электрофореза. При оптимальных условиях электроиммунного анализа (ЭИА) формируются узкие, остроконечные преципитаты. Точные измерения показывают, что площадь образующихся преципитатов находится в прямой зависимости от концентрации белка.

Электроиммуиный анализ: кривая для определения альбумина

Электроиммуиный анализ: кривая для определения альбумина

При условии, что преципитаты будут иметь описаннную выше форму, для практических целей можно ограничиться измерением длины зоны преципитации.

Электрофорез

Преципитаты приобретают характерную вытянутую форму только при достаточной длительности электрофореза. Необходимое для этого время зависит от исследуемой системы и от приложенного напряжения. Создать достаточно эффективное напряжение можно только при надлежащем охлаждении камеры. Обычно напряжение варьирует от 5 до 20 В/см. Ионная сила буферов составляет 0,02—0,1. В зависимости от имеющегося оборудования можно вносить те или иные методические изменения. При большой длительности электрофореза и низком напряжении можно отказаться от охлаждения и уменьшить содержание АС в геле до 0,3%.

Определение иммуноглобулинов

При ЭИА иммуноглобулины, как правило, проявляют незначительную подвижность как в катодном, так и в анодном направлении. Это наблюдение относится к IgG и IgM. Вокруг стартовой лунки образуется широкий двойной «шлейф».

Для предупреждения этих явлений пользуются следующими приемами:

1. Вместо агарозы используют 1% агар, учитывая его повышенный электроэндоосмос. Образуются довольно широкие, с закругленным концом преципитаты, направленные к катоду.

2. Широкое распространение получила обработка белков, например сыворотки, 2 М раствором KCNO. Один объем сыворотки смешивают с двумя объемами раствора цианата калия при комнатной температуре и оставляют смесь на ночь или равные объемы обоих растворов инкубируют 30 мин при 45 °С. Затем делают необходимое разведение вероналовым буфером и проводят электрофорез. Цианат реагирует со свободными NH2-и SH-группами, повышая общий отрицательный заряд белковых молекул, что приводит к более быстрому их передвижению в сторону анода.

3. Похожие результаты получаются при обработке образцов сыворотки β-пропиолактоном. Это вещество не меняет антигенные свойства Ig.

4. Для заливки пластин с гелем используют карбамилированную АС. Электрофорез проводят при рН5 — изоэлектриче-ской точке карбамилированных Ig. В этих условиях иммуно-глобуллины АС остаются неподвижными в геле, a Ig исследуемого образца мигрируют только в сторону катода.

5. Образцы сыворотки обрабатывают глютаровым альдегидом, что приводит к конъюгированию Ig с электрофоретически более подвижными белками, в первую очередь с альбумином. Антигенные детерминанты Ig остаются «свободными», поэтому преципитаты образуются в анодной области в условиях электрофореза при рН 8,6.

Модификации метода

ЭИА можно проводить на ацетат-целлюлозных пленках. Для осуществления такого анализа требуются меньшие количества АС. Дальнейшим развитием ЭИА является двумерный количественный иммуноэлектрофорез. При помощи ЭИА с небольшими модификациями можно идентифицировать различные АГ и оценивать количество перекрестно реагирующих АТ (антитело) в антисыворотке. Обратный ЭИА позволяет устанавливать титр АТ (антитело) в АС. Электрофорез проводят при рН 4,85, т. е. изоэлектрической точке альбумина. Мигрируют только АТ (антитело) и только в катодном направлении (см. выше). Для определения продуктов расщепления фактора комплемента 3 (С Зс и С 3d) используют «двухслойный» ЭИА. АГ сыворотки начинают двигаться в геле без АС, переходят в гель, содержащий АС к С Зс, сиова переходят в зону геля без АС и, наконец, оказываются в слое геля с АС к С 3d. Секреторный SIgA и секреторный компонент (СК) могут определяться одновременно в одной пластине с гелем, состоящим из смеси агара и агарозы и содержащим кальциевую соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) и карбамилированную сыворотку. В этих условиях SIgA мигрирует в сторону катода, СК—в сторону анода. В заключение следует упомянуть о том, что ЭИА может быть использован для определения нерастворимых белков эпидермиса, ногтей и волос, например кератина. Электрофорез проводят в присутствии денатурирующих реагентов (ДСН, мочевина).