Главная

Определение аффинности методом осаждения сульфатом аммония

Материалы и оборудование
Постановка опыта
Оценка результатов
Оценка метода

Определение свободного (с) и связанного (b) гаптена необходимо для оценки аффинности, оно требует разделения обоих компонентов. Иммуноглобулины осаждаются в мягких условиях из раствора при 33—55% насыщения сульфатом аммония без потери сродства к гаптену. Поэтому относительно просто измерить количество гаптена, связанного находящимися в осадке антителами и свободного гаптена в надосадочной жидкости. В дальнейшем этот метод будет подробно описан для оценки взаимодействия анти-ДНФ-антител с ε-ДНФ-L-лизином.

Материалы и оборудование

Для работы необходимы:
анти-ДНФ-антисыворотка или специфически очищенные анти-ДНФ-антитела;
3Н-ε-ДНФ-L-лизин;
нормальная сыворотка,
фосфатный буфер (0,01 М фосфат рН 7,4; 0,15 М NaCl);
насыщенный на холоду раствор сульфата аммония;
центрифуга с охлаждением;
пластиковые пробирки;
автоматические пипетки (50 и 100 мкл);
жидкостный сцинтилляционный счетчик.

Постановка опыта

Для проведения эксперимента можно использовать очищенные антитела или просто антисыворотки. Очищенные антитела растворяют в нормальной сыворотке, разведенной в соотношении 1 :5 или 1 :10, обладающей низким сродством к соответствующему гаптену. Исследуемые антисыворотки, если они содержат достаточное количество белка, также разводят в соотношении 1 : 5 или 1:10. При необходимости делают дальнейшие разведения.

К 50 мкл раствора антител приливают пипеткой 50 мкл раствора гаптена. В качестве контроля неспецифического связывания используют нормальную сыворотку в тех же степенях разведения. В зависимости от необходимой точности для определения аффинности применяют 5—20 различных концентраций гаптена, перекрывающих охватывающую три порядка область концентраций (например, от 10-5 М до 10-7 М). Оба компонента тщательно перемешивают и выдерживают при 4 °С в течение 1 часа. Затем прибавляют равный объем (100 мкмл) насыщенного раствора сульфата аммония при температуре 4°С и немедленно перемешивают, чтобы избежать денатурации AT.

После 30-минутной инкубации при 4°С, в течение которой дважды проводят кратковременное встряхивание, пробирки центрифугируют в течение 15 мин при 5000 об/мин при той же температуре. Надосадочную фракцию в количестве 100 мкл, в которой определяют концентрацию свободного гаптена, переносят в 10 мл сцинтиллятора (жидкость Брея). Измеряют радиоактивность образца с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Оценка результатов

Количество свободного гаптена (с) определяют непосредственно по радиоактивности материала. Количество связанного с антителами гаптена (b) вычисляют по разности между радиоактивностью надосадочной фракции раствора, содержащего специфические антитела, и раствора, содержащего нормальную сыворотку. Если концентрация антител известна, то b может быть преобразовано в г (молярное соотношение Г/АТ).

Оценка метода

Метод осаждения сульфатом аммония технически проще и требует меньше времени, чем равновесный диализ. Значения Ка получаемые с его помощью, отличаются от получаемых равновесным диализом, но обладают хорошей воспроизводимостью. Обсчет результатов по уравнению Сипса часто приводит к высоким индексам гетерогенности, что с точки зрения условий связывания соответствует несколько меньшей гетерогенности популяции AT.

Антитела с низкой аффинностью так сильно изменяются при осаждении, что теряют способность связывания, это в свою очередь приводит к искажению спектра антител, обусловленному техникой измерения. Это следует особенно учитывать при анализе систем с большой долей низкоаффинных антител, следует также контролировать результаты, получаемые при осаждении сульфатом аммония методом равновесного диализа.