![]() | |
Главная
|
Расщепление пепсиномМатериалы и оборудование Для работы необходимы: кроличий IgG, кристаллический пепсин, 0,1 М ацетатный буфер с рН 4,5, 1 М NaOH, Na2S04. Методика Обрабатывают 2 г IgG кролика 20 мг кристаллического пепсина в 76 мл ацетатного буфера с рН 4,5, проводят гидролиз в течение 20 ч при 37°С. Смесь центрифугируют, рН надосадочной фракции доводят до 8,0 1 М NaOH. Медленно при комнатной температуре и при постоянном помешивании добавляют раствор сульфата натрия (25 г/100 мл) до конечной концентрации 18 г/100 мл. Осадок собирают центрифугированием, растворяют в воде и диализуют против 0,1 М ацетата натрия. Обсуждение При фрагментации IgG пепсином образуются Р(аb´)2-фрагменты с константой седиментации 5S, остальная часть молекулы распадается на низкомолекулярные пептиды. Очистку фрагментов проводят методом гель-фильтрации. Первое разделение проводят на сефадексе G-100; нефрагмеитированный IgG удаляют на сефадексе G-150, дальнейшую очистку ведут на КМ-сефадексе G-25 в 0,02 М ацетатном буфере с рН 5,5. После восстановления 0,01 М меркаптоэтиламином в течение 75 мин в 0,1 М ацетатном буфере с рН 5,0 из Р(аb´)2-фрагментов образуются моновалентные Fab´-фрагменты; этот процесс обратим (окисление), если не проводилось алкилирование. При восстановлении 0,1—0,2 М меркаптоэтанолом образуются легкие цепи и Fd´-фрагменты. Относительная молекулярная масса Fd´-фрагмента IgG человека составляет 31 500. Его можно отделить от легких цепей хроматографией на сефадексе G-100 в 6 М мочевине с 0,1 М уксусной или 1 М пропионовой кислотами. Под воздействием пепсина образуется также pFc´-фрагмент с отн. мол. массой 26 000. Он выходит с сефадекса G-150 во втором пике и может быть очищен повторной хроматографией на сефадексе G-50. pFc´-фрагмент состоит из двух ковалентно связанных субъединиц. Папаином расщепляют pFc´- на Fc´-фрагмент и пептиды (см. рисунки ниже). Схема получения фрагмента pFc1
pFc1- и Fc'-фрагменты IgG
Раb´-фрагменты оказались очень полезными для использования в методе меченных ферментом антител. F(ab´)2- и Fab´-фрагменты IgG кролика получают по следующей методике. а) Получение F(аb´)2-фрагментов
б) Получение Fab´-фрагментов
Для получения F(аb´)2-фрагментов из небольших количеств сыворотки пепсиновому протеолизу подвергают глобулиновую фракцию. Затем проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-150. Во втором пике присутствует F(ab´)2. Оптимальные условия расщепления IgG различных биологических видов пепсином определяют под контролем диск-электрофореза с ДСН. Известны различия в чувствительности к пепсину в пределах субкласса IgG, например, у крыс они выражены следующим образом: IgG 2c>IgG 2b>IgG 2a>IgG 1. Протеолиз IgM человека пепсином приводит через 8 ч к его полному распаду на пептиды. Более короткий по времени протеолиз приводит к образованию F(ab´´)2μ, распадающиеся потом на Fab´μ. Фрагменты выделяют методом гель-фильтрации на сефадексе G-200, их обозначают F(ab´)2 (IgM) или Fab pep (IgM). |
|