Главная

• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Культивирование макрофагов и моноцитов. Методика

Материалы и оборудование

а) Для получения пернтонеальных клеток необходимы инбредные мыши различных штаммов в возрасте 3—4 мес, изотонический фосфатный буфер (например, Институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин), после получения сухого препарата его растворяют в тридистиллированной воде и проводят стерилизацию фильтрованием при 4°С 4—6 нед. Нужно иметь также раствор гепарина без консервантов (5000 МЕ/мл), сыворотку эмбрионов коров, инактнвированную нагреванием в течение 30 мин при 56 °С, 70% этанол, вату, кубики льда, анатомические пинцеты, ножницы, стеклянные шприцы на 10 и 20 мл, стальные иглы № 16 и 18, стакан на 400 мл, силиконизированные стеклянные центрифужные пробирки на 25 мл, настольную центрифугу,

б) Для подсчета и дифференциального определения макрофагов и моноцитов используют смесь цитрат/NаСl (8 объемов 1М NaCl+ 2 объема 1М лимонной кислоты; подводят рН 20% NaOH до 3,0—3,5 при 4°С после добавления небольшого количества тимола), 0,1% раствор кристаллического фиолетового в 1М лимонной кислоте, 0,1% раствор нейтрального красного в дистиллированной воде (краситель хранят при комнатной температуре несколько месяцев), раствор туши (коммерческую черную тушь разводят в соотношении 1 : 20 0,15 М NaCl, автоклавируют), мерные пипеткидля лейкоцитов и эритроцитов, камеру Biirker, обогреваемый столик, световой микроскоп,

в) Для получения культур макрофагов и моноцитов нужно иметь раствор Хенкса (например, Институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин), концентрат растворяют в тридистиллированной воде, стерилизуют фильтрацией, хранят при 4°С в течение 4—6 нед; среду Игла-МЕМ (тот же поставщик) и PPMI 1640; к средам добавляют по 2 г гидрокарбоната натрия и по 290 мг глутамина, растворяют в 1 л тридистиллированной воды, стерилизуют фильтрацией, хранят 4—6 нед при 4°С. Также необходимы растворы антибиотиков: 1 000 000 ЕД пенициллина +1 г стрептомицина растворяют в 100 мл тридистиллированной воды, стерилизуют фильтрацией, делят на небольшие порции и сохраняют при —20°С, инактивированная сыворотка эмбрионов коров, нормальная лошадиная сыворотка (инактивированная), человеческая сыворотка (инактивированная), газовая смесь: 92,5 частей воздуха и 7,5 частей СОг, стеклянные чашки Петри диаметром 5 см, пипетки на 1, 5 и 10 мл, мерные цилиндры на 50 и 100 мл, эрленмейеровские колбы на 50 и 100 мл, эксикатор, термостат, качалка.

Для силиконирования стеклянной посуды ее скачивают раствором силикона (Serva, ФРГ) и высушивают 1 ч при 100 °С. Способы очистки посуды см. раздел "Образование антител культурами клеток". Посуду упаковывают в алюминиевую фольгу и стерилизуют 2 ч при 180 °С. Так же стерилизуют ножницы и пинцеты. Растворы и среды стерилизуют пропусканием через антибактериальный фильтр G5.

Получение макрофаги моноцитсодержащих суспензии клеток

а) Получение перитонеальных клеток: мышей забивают цервикальной дислокацией. Шкуру животного смачивают 70% этанолом. Захватывают пинцетом шкуру на животе и делают надрез ножницами с таким расчетом, чтобы разрез раздвигался в краниально-каудальном направлении. В брюшную полость вводят 3—4 мл жидкости (изотонический буфер с добавлением 5000 ЕД гепарина и 20 мл сыворотки эмбрионов коров из расчета на 1л). Жидкость вводят осторожно, стараясь не повредить кишечник, слегка приподнимая брюшную стенку пинцетом. После инъекции живот массируют большим и указательным пальцами 20—30 сек. Перитонеальную жидкость медленно отсасывают шприцем. Для этого иглу вводят в латеральную часть живота параллельно брюшной стенке. Рекомендуется отсасывать перитонеальную жидкость с обеих сторон живота, тогда из 4 мл введенной жидкости получают 3,5 мл перитонеальной жидкости, которую собирают в охлажденные до 0°С силиконнзированные центрифужные пробирки. Перитонеальную жидкость, загрязненную кровью, не используют. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 150 g, ресус-пендируют осадок в растворе Хенкса. До засева культуры клетки сохраняют на льду. Ниже приводится состав клеток перитонеальной жидкости у различных штаммов мышей.

Состав клеток перитонеальной жидкости у различных штаммов мышей

Примечание. Представлены данные от 5 животных 3-месячного возраста, в скобках — размах вариации.

Внутрибрюшинное введение различных раздражающих средств за 3—4 дня до получения перитонеальной жидкости существенно увеличивает число клеток и содержание в них макрофагов.

Влияние различных раздражающих веществ на число и состав клеток перитонеального экссудата (данные получены на мышах СБА)

Следует указать, что индуцированные перитонеальные макрофаги отличаются по целому ряду свойств от неиндуцированных. К числу таких свойств относятся усиление пиноцитоза и фагоцитоза, а также усиление секреции биологически активных веществ in vitro.

б) Получение мононуклеаров из крови: мононуклеары получают из гепаринизированной крови (10 ME гепарина/мл), см. раздел "Разделение клеток иммунной системы".

Идентификация и подсчет макрофагов и моноцитов

Клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым или нейтральным красным, идентифицируют и подсчитывают. В зависимости от густоты суспензии ее разводят в пипетке для лейкоцитов или эритроцитов раствором одного из красителей и переносят в камеру Biirker (смешивают 1 мл раствора кристаллического фиолетового с 10 мл цитрат/NaCl и 90 мл дистиллированной воды или 0,5 мл раствора нейтрального красного с 9 мл раствора Хенкса и 1 мл сыворотки эмбрионов коров, можно лошадиной). При окрашивании кристаллическим фиолетовым клетки подсчитывают через 5 минут после заполнения камеры, при окраске нейтральным красным подсчет ведут через 5— 10 мин после выдерживания камеры на подогретом до 37 °С столике. Кристаллический фиолетовый окрашивает ядра клеток. Это дает возможность отдифференцировать макрофаги и моноциты от лимфоцитов и гранулоцитов. Они выглядят как крупные клетки с круглым или овальным ядром. В их цитоплазме присутствуют светопреломляющие гранулы. Эритроциты при окраске лизируются, поскольку раствор кристаллического фиолетового сильно гипотоничен. Только макрофаги и моноциты прокрашиваются нейтральным красным, в вакуолях которых он откладывается. При подсчете клеток рекомендуется просчитывать 3 группы квадратов камеры Biirker по диагонали из левого верхнего угла в правый нижний. Расчет ведут по следующей формуле:

¹ Фактор разведения — величина, обратная степени разведения

Идентификацию макрофагов и моноцитов в культуре проводят по захвату ими нейтрального красного или коллоидного угля. Для этой цели к культуре клеток добавляют 0,2 мл разведенного нейтрального красного или 0,1 мл разведенной туши. Инкубируют смесь 10 мин при 37 °С и подсчитывают клетки, окрашенные нейтральным красным. Клетки, захватывающие тушь, подсчитывают через 30—60 мин инкубации после отмывания избытка туши. Подсчет клеток ведут под микроскопом, перевернув чашку Петри вверх дном.

Получение культур макрофагов и моноцитов

Готовят среду (Игла-МЕМ или RPMI 1640), добавляя 10 мл сыворотки эмбрионов коров или сыворотки человека группы АВ и 2 мл растворов антибиотиков к 88 мл среды. Сыворотку эмбрионов коров лучше использовать для улучшения культуры мышиных перитонеальных макрофагов, сыворотку АВ — для культивирования моноцитов из крови человека. Количество клеток, которое вносят в культуральную среду, определяется стоящей перед исследователем задачей.

После тщательного перемешивания с культуральной средой суспензию клеток разливают по чашкам Петри (2 мл на чашку), которые затем помещают в эксикатор. Клетки культивируют при 37 °С в водонасыщенной атмосфере, содержащей 7,5% СО₂. После 30—60-минутной инкубации неадгезировавшие клетки удаляют из чашек Петри. Для этого чашки помещают на 5 мин на качалку (60—80 качаний/мин). Надосадочную фракцию отсасывают шприцем, остающийся монослой клеток смывают раствором Хенкса. Для этого в чашки вносят по 2 мл раствора Хенкса и в течение 10 секунд резко качают их в горизонтальном направлении. Раствор Хенкса отсасывают, повторяют процесс отмывки 4 раза, затем инкубируют чашки 24 часа при 37 °С, предварительно добавив 2 мл свежей культуральной среды. В случае работы с перитонеальными клетками получают монослой, состоящий по меньшей мере на 98% из макрофагов. При постоянном культивировании макрофагов или моноцитов каждые 3—4 дня необходимо менять среду. При замене среды монослой клеток несколько раз отмывают раствором Хенкса для удаления погибших макрофагов.

Модификация метода

Если жидкая фаза культуры макрофагов (моноцитов) должна анализироваться при помощи культуры антителообразующих спленоцитов, макрофаги желательно культивировать в той же среде, что и спленоциты (см. раздел "Образование антител культурами клеток"). Иногда возникает необходимость получать большие количества макрофагов, например для изготовления антимакрофагальной сыворотки. В этих случаях суспензию макрофагов (1—2х10⁶ клеток/мл) разливают по 10 мл в чашки Петри диаметром 12 см. В культуральной среде можно при этом заменить добавку 10% сыворотки эмбрионов коров и 20% инактивированной лошадиной сыворотки. Обработку культур проводят как описано выше. Культивирование осуществляют в течение 3—4 дней с ежедневной сменой среды. Образующиеся монослои более чем на 99% состоят из макрофагов. Макрофаги осторожно отделяют от дна чашки стеклянной палочкой, на которую надет кусок мягкого пластикового шланга, выступающий за конец палочки на 10 мм.

Для гистологических или гистохимических исследований рекомендуется культивировать клетки на стеклянных пластинах. Для этой цели одну каплю суспензии клеток наносят на стеклянные пластины, которые инкубируют 1 ч во влажной камере. Неадгезировавшие клетки смывают раствором Хенкса и пластинки помещают в чашки Петри с культуральной средой. Поверхность пластин должна быть покрыта культуральной средой. По окончании культивирования стеклянные пластины отмывают изотоническим буфером, фиксируют клетки любым подходящим способом и окрашивают соответствующим красителем.